彼得·派克七岁时在家中捉迷藏，发现父亲理查德·派克（英语：Richard and Mary Parker）的私人工作室遭窃，导致理查德极为紧张，清除所有研究资料后收拾包裹，将彼得寄放在哥哥班·派克和其妻子梅家中后一去不回，然而没过几天，理查德夫妇双双死于坠机意外。十年后，彼得在中城高中（英语：Midtown High School）就读，某天整理家中地下室时发现他父亲的随身公事包，找到一张父亲在奥氏企业（英语：Oscorp）跟一名独臂男人的照片，以及被父亲封为机密的档案夹。彼得得知独臂男人的身份为奥氏企业基因工程博士柯特·康纳斯。彼得溜进企业大楼试图见康纳斯，希望能问出格温于父亲的事情，却巧遇他的同学兼康纳斯的私人助理格温·斯黛西。彼得偷偷进入秘密研究中心的基因改造蜘蛛培育区，一只变种蜘蛛掉落于他身上且咬下一口，让彼得身体里出现一股跟蜘蛛相似的强大力量、速度和敏捷力。
读完父亲的档案以及康纳斯的科学论书后，彼得亲自拜访康纳斯，并将他父亲文件上的“衰变率算法”写给他。康纳斯发现公式可能会完成他的理论，便邀请彼得来到奥氏企业合作，透过算法而将蜥蜴的断肢再生基因成功合成制出药体。彼得由于顾著项目而忘记去接梅回家，遭到班的责骂与迁就离开已久的父亲后负气出走，当他走进一家便利店时，目睹一位戴墨镜的抢劫犯抢钱。彼得为了报复态度蛮横的店主而选择置之不理，但班这时出来寻找彼得刚好出现在街角，为了阻止抢劫犯而不幸中枪身亡，这让彼得陷入无尽的悔恨，只能够借由班叔留的语音留言吊念他。通过抢劫犯左手臂上的星星纹身，彼得开始活用能力在纽约各处寻找那名抢劫犯却一无所获。一晚，彼得从屋顶掉进一个荒废拳击场时，透过一个蒙面选手海报萌发他的英雄身份“蜘蛛侠”。
彼得随后订购很多高科技产品，包括防护紧身衣与负责拉动飞机的高级钢力黏着线，几个月下来化身蜘蛛侠寻找抢劫犯，也顺便帮警察捕获一些犯罪分子，但警察却将他一同视为罪犯，由格温的父亲兼纽约市警察队长乔治·斯黛西（英语：George Stacy）担任搜捕蜘蛛侠的总指挥。康纳斯虽然完善药剂，但他的上司拉杰特·拉塔急切想将药剂作为拯救老板诺曼·奥斯本的良药，迫使康纳斯对自己注射药物进行实验，最后成功长出右臂。但药物却自行产生副作用，使康纳斯开始变异成一头类人蜥蜴，跑到威廉斯堡大桥上袭击在桥上的拉塔。与此同时，彼得受到格温的邀请而去她家吃晚饭，偷偷向她表露自己的真实身份，当康纳斯在桥上大肆破坏，将拉塔乘坐的汽车直接扔下桥时，彼得及时赶到而将所有掉下去的汽车全部用蜘蛛丝吊起，将困在车里的一个小孩救上来。
康纳斯躲入下水道后因药效消失而恢复人形，彼得回到公司时发现一只实验白老鼠也因药物作用变成一只蜥蜴，打算向警察举报却不被乔治相信。彼得为了搜集证据，一人爬入下水道深处，决定设陷阱去拍摄蜥蜴的照片，跟刚好变成蜥蜴人的康纳斯正面交锋，负伤之下被迫逃跑，康纳斯也透过彼得黏在墙上的照相机姓名发现彼得就是蜘蛛侠。为了避免彼得干预他的计划，康纳斯于隔天早上爬进中城高中与彼得正面交锋，两者在不分上下后，警察赶到使得康纳斯逃回下水道。彼得一路跟到下水道里找到康纳斯的地下藏身处，从他电脑上保留的自白影片和桌上图纸得知，康纳斯计划在奥氏企业顶楼通过气体扩散装置来扩散药物，将纽约乃至全世界的人类转变成蜥蜴人。当时注射大量药物的康纳斯释放一部分气体到大街上造成骚乱，让追捕的警察同样受感染。
格温迅速回公司透过康纳斯的文件着手制出攻克蜥蜴药剂的解药，彼得赶往奥氏企业大楼的过程中遭到乔治率领的警队围捕，最后被电击器械捕获。乔治摘下他的面罩发现他是彼得后，得知格温还在公司里而决定放走他。过程中被击伤腿部的彼得发现他无法及时赶去企业大楼时，但在桥上被蜘蛛侠救过儿子的建筑工人决定报恩，号召街道上所有起重机为他开路，让彼得利用起重机进行蜘蛛丝飞行以加快速度。康纳斯在铁塔上启动装置限时两分钟发射，彼得赶到跟他正面交锋时几近被打死。乔治带着格温交给他的解药上来一同支援，用散弹枪打断并释放液氮管道，让康纳斯暂时被制伏。然而，液氮刚好用完而让康纳斯脱身，长回利爪后将乔治严重刺伤。彼得及时安装上解药发射至空中扩散至全市，让康纳斯与其他感染者恢复人形。
当受损的铁塔倒塌时，恢复人性的康纳斯及时向彼得伸出援手，重伤临死的乔治对彼得表示先前误解的歉意后，让彼得发誓“永远不要再牵扯格温”后死去。随着康纳斯被逮捕，英勇牺牲的乔治被安葬，彼得只能忍痛与格温保持距离来兑现承诺；即使如此，彼得和格温两人的心里仍然在意对方。当康纳斯入狱后，一名神秘老人突然出现在他的牢房，质问康纳斯是否已经将彼得的父亲理查德死亡的“真相”告知彼得。康纳斯回答没有且威胁对方不准对彼得出手后，老人声言自己会姑且先放任他后消失无踪。